В Корее смогли получить из крови мышечно-сосудистые ткани, позволяющую лечить обширные повреждения мышц без иммунного отторжения

Корреспондент Гу Бон Хёк

- UNIST и Университет Ёнсе разработали платформу для создания васкуляризированных мышечных тканей

Схематическое изображение процесса формирования SPARC (пространственно-химерной, плазменной, анизотропной и чувствительной к сдвигу структуры) при пространственно-определенных градиентах сдвигового напряжения [Предоставлено UNIST]

В Корее разработали технологию выращивания индивидуализированных мышечно-сосудистых тканей, позволяющую одновременно регенерировать мышцы и сосуды с использованием крови самого пациента. Ожидается, что эта технология, при которой сосуды и мышцы могут сосуществовать вместе, как в настоящих биологических тканях, станет новой альтернативой в лечении повреждений мышц.

Корейский фонд научных исследований сообщил, что исследовательская группа во главе с профессором Кан Чжу Хона из Ульсанского национального института науки и технологии (UNIST) и профессора Чин Юн Хи из Медицинской школы Университета Ёнсе разработали платформу «SPARC» для создания васкуляризированных мышечных тканей с использованием напряжения сдвига на основе микрогидродинамики.

Обширные повреждения мышц — это заболевание, при котором мышцы широко разрушаются в результате травм или удаления опухолей. В этом случае мышцы и кровеносные сосуды разрушаются одновременно, что делает естественное восстановление практически невозможным, а существующие трансплантаты были ограничены в одновременной регенерации обеих тканей, поскольку они сосредоточивались только на одном из двух: либо выравнивании мышц, либо формировании сосудов.

Исследовательская группа обратила внимание на «фибрин» — белок, образующийся в процессе свертывания крови. Фибрин можно получить непосредственно из крови пациента, что делает его индивидуализированным материалом с низким риском иммунного отторжения.

В тех участках платформы, где напряжение сдвига было высоким, пучки фибрина плотно выстраивались в ряд, создавая твердую среду, подходящую для дифференцировки мышечных клеток, а в участках с низким напряжением сдвига формировалась гибкая структура, создавая благоприятную среду для образования сети сосудистых клеток. В результате в пределах одной структуры мышцы и сосуды были пространственно разделены и росли одновременно.

Рис 1. Формирование пучков фибрина, пропорциональное сдвиговому напряжению, приводит к образованию анизотропной и механически неоднородной структуры. (а) Схематическое изображение процесса формирования SPARC (пространственно-химерной, плазменной, анизотропной и чувствительной к сдвигу структуры) при пространственно-определенных градиентах сдвигового напряжения. Кровяная плазма протекает через микрофлюидный канал, содержащий массив микростолбиков, который создает локальные изменения скорости сдвига, вызывая анизотропное скручивание фибрина. (b) Схема собранного микрофлюидного устройства из PDMS с входным и выходным отверстиями для перфузии плазмы с низким содержанием тромбоцитов (PPP), содержащей миобласты и эндотелиальные клетки (слева), и схема SPARC после извлечения из формы канала из PDMS (справа). (c) Фотографии полностью собранного устройства из PDMS (слева) и извлеченного из формы SPARC (справа) (масштабные линейки = 1 см). (d) Карта вычислительной гидродинамики (CFD) с моделированием линий тока потока через геометрию микростолбиков, иллюстрирующая направленные траектории потока и величину скорости (мм/с−1). (e) Компьютерное моделирование градиентов скорости сдвига по массиву столбиков. (f) Карта поперечного сечения скорости сдвига, предсказанная CFD между соседними микростолбиками. (g) Изображения сканирующего электронного микроскопа (SEM) демонстрируют гетерогенную архитектуру пучков фибрина вдоль оси x (масштабная линейка = 50 мкм). Правые панели: увеличенные виды областей 1–4 (масштабная линейка = 5 мкм). (h) Распределение диаметров волокон по областям 1–4 с полярными графиками, отображающими анизотропную ориентацию пучков фибрина. (i) Изображения СЭМ поперечных сечений пучков фибрина в областях 5–8 и (j) соответствующая площадь поперечного сечения (CSA) пучков волокон по областям (n = 11). Статистический анализ проводился с помощью одностороннего ANOVA с последующим пост-хок тестом Тьюки (*P < 0,05, P < 0,01, *P < 0,001 по сравнению с указанными группами). (k) Схема установки атомно-силового микроскопа (AFM) для картирования локальной жесткости и графики модуля Юнга для бесклеточных конструкций SPARC и Static (n = 27–32). (l) Корреляция между диаметром пучка фибрина и локальной жесткостью в бесклеточном SPARC. Соответствующие локальные модули упругости были измерены с помощью AFM в сопоставимых положениях. [Предоставлено UNIST]

Рис 2. Механическое и структурное регулирование миогенной дифференцировки в системе SPARC. (a) Изображения, полученные с помощью сканирующего электронного микроскопа (СЭМ) сразу после высева клеток (день 0), показывают хаотично ориентированные миобласты и фибриновые сети в трехмерных фибриновых конструкциях, сформированных в статических условиях (M-Static), и в мышечных конструкциях, сформированных под действием сдвига (M-SPARC) (масштабная линейка = 10 мкм). (b) Флуоресцентные изображения филаментарного актина (фаллоидин, красный) и ядер (DAPI, синий) на 3-й день (масштабная линейка = 100 мкм). Графики углового распределения сравнивают ориентацию цитоскелета для клеток в M-Static и M-SPARC. (c) Иммуноокрашивание на миогенные маркеры MyoD, MyoG, MyHC и SAA на 6-й день культивирования (масштабная линейка = 50 мкм). (d) Количественная оценка интенсивности флуоресценции для всех четырех миогенных маркеров в M-Static и M-SPARC (n = 5–6). (e) Количественная оценка миоядер на миотубу (n = 30) и индекса слияния (n = 4). (f) Анализ экспрессии Myog и Myh1 методом qRT-PCR в M-Static и M-SPARC (n = 4). (g) Визуализация с помощью Fluo-4 реакций [Ca2+], индуцированных ацетилхолином (200 мкМ). Показаны сигналы флуоресценции ΔF/F0 для определенных областей интереса (масштабные линейки = 50 мкм). (h) Визуализация кальция с помощью Fluo-4 в ответ на ацетилхолин (200 мкм), демонстрирующая переходные процессы [Ca2+] (ΔF/F0), количественно оцененные в определенных областях интереса (n = 30–40). (i) Типичные кривые сокращения при полевой стимуляции с частотой 0,5 и 1 Гц (5 В). (j) Схема кинетики миотропного сокращения, показывающая время до пикового напряжения (TPT) и время полурелаксации (HRT). (k) Количественная оценка нормализованной амплитуды сокращения, TPT и HRT (n = 6). Все статистические анализы проводились с использованием непарных t-критериев (*P < 0,05, P < 0,01, *P < 0,001 по сравнению с группой M-Static).

Рис 3. Пространственное расхождение миогенных и эндотелиальных реакций в пределах SPARC. (a) Типичные иммунофлуоресцентные изображения SAA (слева) и MyHC (справа) с ядрами, окрашенными в синий цвет (масштабные линейки = 100 мкм). A = область с высоким сдвигом вблизи микростолбика; B = область с низким сдвигом между микростолбиками. (b) Количественный анализ интенсивности флуоресценции SAA (слева), MyHC и CD31 (справа) от области A до B, демонстрирующий взаимное распределение сигнала вдоль оси сдвига. (c) Иммунофлуоресцентные изображения MyHC (красный), CD31 (зеленый) и ядер (синий) в областях с высоким и низким сдвигом, представленные в виде вида сверху (плоскость x-y) и ортогональных проекций — z-x (в центре) и z-y (внизу) (масштабные линейки = 150 и 20 мкм). (d) Анализ qRT-PCR миогенных регуляторов (Myod1, Myf5, Myog) и поздних структурных маркеров (Myh1/2/4/7) в VM-SPARC по сравнению с контрольными группами (2D-культура, VM-Static-NP и VM-Static) (n = 3). (e) Анализ qRT-PCR сосудистых маркеров (CD31, CD34, CD144 и VWF) в VM-SPARC и контрольных конструкциях (n = 3). (f) Совместное окрашивание Ki67 с маркерами линии в VM-Static и VM-SPARC. Эндотелиальные клетки идентифицировали по CD31, а миогенные — по SAA (масштабные линейки = 50 мкм). Желтые стрелки указывают на Ki67+-клетки, колокализующиеся с маркерами линии. (g) Количественная оценка Ki67+CD31+-эндотелиальных клеток и Ki67+SAA+-миогенных клеток в различных условиях (n = 4). (h) Анализ экспрессии миогенных генов методом qRT-PCR в конструкциях, состоящих исключительно из миогенных клеток (M-SPARC), и в конструкциях, полученных путем совместного культивирования (VM-SPARC) (n = 3). (i) Анализ экспрессии эндотелиальных маркеров методом qRT-PCR в конструкциях, состоящих исключительно из эндотелиальных клеток (V-SPARC), и в VM-SPARC (n = 3). (j) Изображения SEM конструкций VM-Static (слева) и VM-SPARC (справа) после 7 дней культивирования. Изображения с низким увеличением показывают общую морфологию конструкции (масштабные линейки = 1 мм, 100 мкм), а пронумерованные области соответствуют изображениям с более высоким увеличением клеток (пурпурный цвет) внутри микроструктуры фибрина (масштабные линейки = 10–20 мкм). Статистический анализ проводился с использованием одностороннего ANOVA с пост-хок тестом Тьюки (d, e, g) или непарного t-теста (h, i). (*p < 0,05, p < 0,01, *p < 0,001).

Рис. 4. Ускоренная регенерация мышц через 2 недели после трансплантации VM-SPARC. (a) Типичные гистологические (H&E, MT) и иммуногистохимические (MyHC, CD31) препараты участков дефекта из групп «Без лечения», «VM-Static-NP», «VM-Static», «M-SPARC», «VM-SPARC» и «Без повреждения» (масштабные линейки: H&E = 200 мкм; MT = 1 мм и 200 мкм; MyHC = 50 мкм; CD31 = 100 мкм). (b–d) Количественная оценка площади фиброза (n = 4) (b), площади MyHC+ (n = 4) (c) и площади CD31+ (n = 5) (d) по группам, измеренная на иммуноокрашенных срезах. Все статистические анализы проводились с использованием одностороннего ANOVA с последующим пост-хок тестом Тьюки (***p < 0,001 по сравнению с группой без лечения и ###P < 0,001 по сравнению с группой без повреждений). (e) Иммунофлюоресцентное изображение сосудистого анастомоза с использованием лектина, специфичного к человеку (зеленый), лектина, специфичного к мыши (красный), и DAPI (синий). Ко-локализованный сигнал указывает на соединение между сосудистым руслом человека и хозяина (масштабная линейка = 100 мкм; масштабные линейки на вставке = 50 мкм).

Рис 5. Имплантация VM-SPARC способствует устойчивой регенерации мышц и восстановлению функций через 8 недель после травмы VML. (a) Типичные гистологические (H&E, MT) и иммуногистохимические окраски (MyHC, CD31, ламинин, TUJ1, AChR) регенерированной мышечной ткани в области дефекта (масштабные линейки = 50, 100 и 200 мкм). (b) Частотное распределение площади поперечного сечения мышечных волокон по группам. (c–f) Количественная оценка минимального диаметра Фере (n = 5) (c), площади фиброза (n = 3) (d), площади MyHC+ (n = 3) (e) и площади CD31+ (n = 4) (f) для всех групп. (g, h) Количественный анализ показывает количество AChR-положительных участков (n = 4) (g) и количество участков NMJ (n = 4) (h) по экспериментальным группам. Участки NMJ определялись как области, в которых скопления AChR перекрывались с сигналами нейронального маркера (TUJ1) и MyHC. (i,j) Функциональная оценка с помощью теста на усталость на беговой дорожке (n = 4) (i) и теста на висе на горизонтальной перекладине (n = 8) (j) в группах VM-SPARC, VM-Static, VM-Static-NP и Untreated. Статистический анализ проводился с использованием одностороннего ANOVA с последующим пост-хок тестом Тьюки (c–i) или двустороннего ANOVA с последующим пост-хок тестом Тьюки (j). (*p < 0,05, p < 0,01, *p < 0,001 по сравнению с группой «Без лечения» и #p < 0,05, ###p < 0,001 по сравнению с группой «Без травмы»).

Профессор Кан Чжу Хон из UNIST [Предоставлено UNIST]

Испытание на мышиных моделях с повреждением мышц показал, что данная структура успешно соединилась с сосудами хозяина, способствуя регенерации сосудов и ускоряя восстановление мышечных волокон и двигательных функций.

«Данная технология позволяет создавать условия для одновременного роста сосудистых и мышечных клеток, что открывает возможность создания функциональных тканей, более близких к реальным биологическим тканям», сказал профессор Кан Чжу Хон, добавив: «В будущем она может найти широкое применение в лечении различных трудноизлечимых заболеваний, таких как травматические повреждения мышц и дефекты тканей после удаления опухолей».

«Для клинического применения необходимы дополнительные исследования, включая установление процесса изготовления крупных тканей, повышение долгосрочной выживаемости, разработку технологий на основе аутологичных (собственных) клеток пациента и создание производственного процесса на основе GMP» - подчеркнул он.

Результаты данного исследования, проведенного при поддержке Корейского фонда научных исследований, опубликованы 22 апреля в онлайн-версии международного научного журнала по материаловедению «Advanced Materials».

nbgkoo@heraldcorp.com

#южнаякорея #корея #политика #экономика #промышленность #технология #биотехнология #медицина #мышцы #сосуды #регенерация #лечение #бизнес #финансы #общество #культура #искусство #азия