GIST разработал универсальную технологию обнаружения генов, позволяющий диагностировать болезнь за 20 минут без ПЦР
- 1 день назад
- 4 мин. чтения
Корреспондент Гу Бон Хёк
- Команда во главе с профессором Ким Мин Гон из факультета химии смогла регулировать скорость генетической реакции
Ли Хо Ён (слева в заднем ряду), профессор факультета химии; магистрант Ли Кю Хан; аспиранты Пак Чжун Хёк, Пак Ё Чжин; Юн Чжи Ён; профессор Ким Мин Гон; студент программы интегрированной аспирантуры Пак Хён Бин [Предоставлено GIST]
Институт науки и технологий Кванджу (GIST) сообщил, что исследовательская группа под руководством профессора Ким Мин Гона из факультета химии представила технологию генетической диагностики нового поколения, позволяющую гибко проектировать и обнаруживать целевые гены различных заболеваний.
Эта технология позволяет разрабатывать индивидуализированные методы диагностики для «целевых генов», требующих диагностики, и может применяться для диагностики различных заболеваний, таких как инфекционные заболевания, рак и наследственные болезни.
Методы диагностики, основанные на генетической информации (ДНК или РНК), содержащейся в организме или вирусе, широко используются для диагностики различных заболеваний.
Тест с амплификацией генов (ПЦР), который в настоящее время используется в качестве стандартного метода диагностики, демонстрирует высокую точность и чувствительность, но имеет ограничения, связанные с длительностью процедуры, а также необходимостью в специализированном оборудовании и кадрах.
Для преодоления этих ограничений внимание привлекает «метод диагностики в одной пробирке (One-pot CRISPR)», сочетающий в себе «генетические ножницы (CRISPR)», нацеленные на определенные гены, связанные с заболеванием, и «технологию изотермической амплификации», позволяющую быстро и в большом количестве копировать гены при постоянной температуре.
Однако эти технологии отличаются по скорости реакции для обнаружения генов и генерации сигнала, и их сложно регулировать, что затрудняет поиск оптимальных условий для каждого гена и ограничивает гибкость проектирования.
Для преодоления этих ограничений исследовательская группа предложила новый подход, позволяющий универсально обнаруживать «целевые гены», с помощью которого можно диагностировать наличие заболевания, управляя «генетическими ножницами».
В технологии «генетических ножниц» гид (РНК, рибонуклеиновая кислота), выполняющий роль навигатора в автомобиле, находит целевой ген, после чего двигатель (белок Cas, выполняющий функцию разрезания гена), фактически приводящий систему в движение, разрезает ген в этом участке и генерирует сигнал.
Исследователи ввели в этот процесс короткие «генетические фрагменты (олиго)», которые действуют как тормоза, регулирующие скорость, что позволило независимо контролировать скорость процесса разрезания гена и генерации сигнала.
В эксперименте, проведенном исследовательской группой с использованием генетической модели и олиго различной длины, было подтверждено, что скорость реакции точно регулируется в зависимости от длины олиго, и на этом основании были предложены правила для определения оптимальных условий.
Кроме того, при применении результатов эксперимента к 120 образцам, взятым у реальных пациентов, диагноз заражения был поставлен в течение примерно 20 минут, при этом были продемонстрированы точность и чувствительность, сопоставимые с количественным ПЦР (тестом с амплификацией генов), что подтвердило возможность проведения более быстрого и надежного диагностирования по сравнению с существующими методами. Также была доказана возможность клинического применения.
Эта технология не ограничивается конкретными заболеваниями и может универсально применяться к различным генетическим мишеням.
Регулируя дизайн олигонуклеотидов, технологию можно применять в различных областях — от инфекционных заболеваний, таких как COVID-19, до диагностики различных видов рака, — и диагностировать несколько заболеваний с помощью одной платформы.
Кроме того, в отличие от существующих методов, нет необходимости повторно оптимизировать условия для каждого гена, что позволяет упростить дизайн диагностики заболеваний и значительно повысить эффективность разработки.
Рис. 1. Механистическое исследование раздельного контроля расщепления в «однопробирочной» системе. (A) Схематическое изображение флуоресцентного анализа, предназначенного для отслеживания вытеснения олигонуклеотида, меченного кванчером, из crRNA, меченного Cy5. Создано в BioRender, Park, H. (https://BioRender.com/equgvdh). (B–E) Флуоресцентные измерения, демонстрирующие вытеснение РНК-олигонуклеотида и активность «однопробирочной» реакции. Сигнал Cy5 указывает на вытеснение РНК-олигонуклеотида (красный), FAM — на CRISPR-опосредованную «однопробирочную» реакцию (зеленый). (B) Анализ флуоресценции в реальном времени с использованием 12-нуклеотидного РНК-олигонуклеотида, сравнивающий NTC и мишень. Флуоресценция регистрировалась каждые 1 мин в течение 15 мин. (C) Конечный анализ флуоресценции FAM и Cy5 с использованием 12-нуклеотидного олигонуклеотида РНК. Значения P были рассчитаны с помощью непарного двустороннего t-критерия Стьюдента (****P < 0,0001, ***P < 0,001, **P < 0,01, *P < 0,05, ns = не значимо). (D) Конечная интенсивность флуоресценции при различных концентрациях мишени. (E) Конечная интенсивность флуоресценции при различной длине олигонуклеотидов. Все эксперименты проводились в трех повторностях; полоски погрешности представляют среднее значение ± стандартное отклонение (n = 3).
Рис. 2. Настраиваемая «однопробирочная» диагностическая система. (A) Схематическое изображение, сравнивающее два подхода к проектированию «однопробирочных» реакций. Создано в BioRender, Park, H. (https://BioRender.com/jaoj8es). (B–D) Анализ флуоресценции «однопробирочных» реакций при различных концентрациях РНК SARS-CoV-2 с использованием комплексов Cas12a, сформированных с (B) crRNA1, (C) crRNA2 и (D) crRNA3. Для каждого условия показаны два графика: традиционная (слева) и основанная на декуплировании (справа) «однопробирочная» стратегия через 20 мин.
Рис. 3. Клиническая применимость системы CLUE. (A) Клиническое применение системы CLUE с использованием 120 образцов мазков из носоглотки: 30 SARS-CoV-2-положительных, 30 гриппа A-положительных, 30 гриппа B-положительных, 30 отрицательных контрольных образцов. Планка погрешности представляет среднее значение ± стандартное отклонение (n = 3). Пунктирная линия обозначает пороговое значение, определенное максимальным индексом Юдена. (B) Сравнение флуоресцентных сигналов между различными образцами мазков пациентов; значения P были рассчитаны с помощью непарного двустороннего t-критерия Стьюдента (****P < 0,0001, ***P < 0,001, **P < 0,01, *P < 0,05, ns = не значимо). (C) Кривая ROC, построенная на основе клинических образцов. Площадь под кривой (AUC) составила 1,0. (D) Матрица путаницы клинических результатов. Чувствительность составила 100 % (95 % CIs: 88,7 %–100 %), а специфичность — 100 % (95 % CIs: 95,9 %–100 %). Статистическая значимость связи между результатами теста и клиническим статусом определялась с помощью точного критерия Фишера (двустороннее P < 0,0001; отношение шансов = ∞, 95% CIs от 514,4 до ∞).
«Значение данного исследования заключается в том, что оно продемонстрировало возможности диагностической платформы, которую можно адаптировать к различным генетическим мишеням, а не является технологией, предназначенной только для одного конкретного заболевания» - сказал профессор Ким Мин Гон, добавив: «В настоящее время эффективность проверялась в основном на образцах, полученных от пациентов с инфекционными заболеваниями, но мы ожидаем, что технология сможет быть расширена и применена в различных областях, таких как рак и генетические заболевания».
Результаты данного исследования опубликованы 3 марта в международном научном журнале по биохимии и молекулярной биологии «Nucleic Acids Research».
Комментарии