В Корее разрабатывают РНК-препарат для лечения гиперлипидемии, чей эффект сохраняется в течение 4 недель после однократного введения
- 8 часов назад
- 6 мин. чтения
Корреспондент Гу Бон Хёк
- Исследовательская группа из Университета Сеула разработала базовую технологию доставки РНК с высокой дозой и длительным действием
- Эффект подавления генов сохраняется до 7 дней, а снижение уровня триглицеридов у мышей сохраняется в течение 4 недель
Группа корейских учёных разработала новую технологию доставки РНК-препаратов, которая позволяет добиться 4-недельного эффекта после однократного введения и одновременно воздействовать на множество генов, ответственных за развитие различных заболеваний.
28 августа Корейский фонд научных исследований сообщил, что исследовательская группа под руководством профессора Ли Чжон Бома из факультета химической инженерии Университета Сеула разработала «гибридный РНК-наномодуль (L-CRAM)», способный доставлять большое количество коротких интерферирующих РНК (siRNA) непосредственно в цитоплазму и обеспечивать постоянное подавление нескольких целевых генов.
Профессор Ли Чжон Бом из Университета Сеула [Предоставлено Университетом Сеула]
siRNA привлекает внимание как лекарство нового поколения, поскольку позволяет избирательно снижать экспрессию определённых генов, вызывающих заболевания. Однако поскольку siRNA легко распадается в организме и с трудом проникает через клеточную мембрану, для его безопасной доставки необходим специальный носитель.
Широко используемые в настоящее время липидные наночастицы (LNP) имеют ограниченную емкость для РНК. Даже если они проникают внутрь клетки, они задерживаются в мембранных мешочках, называемых «эндосомами», и не могут функционировать должным образом, либо РНК высвобождается сразу, что не позволяет обеспечить длительное действие препарата.
Для решения этой проблемы исследовательская группа создала «CRAM» — пористое РНК-ядро, плотно заполненное последовательностями siRNA. Затем его покрыли липидным слоем, способным непосредственно сливаться с клеточной мембраной, и таким образом получили L-CRAM.
L-CRAM может содержать больше РНК, чем существующие LNP, и, сливаясь с клеточной мембраной, эффективно доставляет РНК-ядро в цитоплазму. Попав в цитоплазму, РНК-ядро постепенно расщепляется под действием ферментов, непрерывно вырабатывая и высвобождая siRNA. По сути, оно выполняет роль своего рода «хранилища РНК-препарата».
В ходе экспериментов на гепатоцитах L-CRAM, нацеленный на APOC3, участвующий в метаболизме триглицеридов, подавил экспрессию этого гена примерно на 70 %. Эффект подавления сохранялся до 7 дней.
В частности, было показано, что, изменив лишь последовательность РНК-модуля, можно подавлять по отдельности или одновременно PCSK9, ANGPTL3 и APOC3, участвующие в метаболизме холестерина и триглицеридов в крови. Это означает, что с помощью одной наночастицы можно одновременно воздействовать на несколько генов, связанных с различными заболеваниями.
Эта возможность была подтверждена и в ходе экспериментов на животных. После внутривенного введения L-CRAM мышам препарат достиг печени и подавил экспрессию APOC3. Уровни триглицеридов и липопротеинов в крови также снизились, причем эффект снижения триглицеридов сохранялся до 4 недель.
Аннотация:
Липидные наночастицы (LNP) являются передовыми носителями siRNA, однако их применение ограничивается умеренной загрузкой РНК, неэффективным выходом из эндосом и кратковременным подавлением экспрессии, обусловленным всплеском высвобождения при выходе из эндосом. Чтобы преодолеть эти ограничения, мы разработали наномодули с липидными слоями и РНК-ядром (L-CRAM), в которых самоорганизующееся РНК-ядро соединено с фузогенными липидами, что обеспечивает устойчивую доставку siRNA с высокой загрузкой. L-CRAM постепенно высвобождают siRNA, демонстрируют внутриклеточную доставку посредством слияния с ограниченным эндо-лизосомальным удержанием и обеспечивают надежное подавление экспрессии как отдельных, так и нескольких целевых генов in vitro. По сравнению с MC3-LNPs, L-CRAMs обеспечивают более длительное внутриклеточное подавление экспрессии генов. После системного введения мышам L-CRAMs вызывали мощное и стойкое подавление экспрессии клинически значимого гена печени APOC3, сопровождающееся снижением уровня триглицеридов (TG) и липопротеинов, богатых триглицеридами (TRL), в сыворотке крови. Благодаря сочетанию сверхвысоких наполнений РНК, фузионного поглощения и программируемого многогенного таргетирования L-CRAM представляют собой универсальную платформу РНК-интерференции длительного действия, которая устраняет ключевые ограничения существующих систем LNP и способствует развитию терапевтической доставки РНК.
Рисунок 1. Схематическое представление L-CRAM для опосредованной слиянием доставки siRNA с высокой пропускной способностью в гепатоциты. (A) Схема получения L-CRAM посредством самосборки in situ конкатемерных РНК-модулей в CRAM, с последующим наслоением липидов, обеспечивающих слияние под руководством ядра. (B) Опосредованная слиянием доставка siRNA с высокой пропускной способностью с помощью L-CRAM.
(i) L-CRAM, содержащие около 50 000 копий siRNA, обеспечивают массовую доставку siRNA после проникновения в клетку. (ii) L-CRAM сливаются с гепатоцитами и способствуют доставке CRAM с ограниченным эндолизосомальным секвестрированием, тогда как стандартные siRNA-LNP содержат около 400 копий siRNA и полагаются на эндосомальный поглощение, что приводит к более низкой эффективности доставки.
(iii, iv) Dicer постепенно расщепляет эти комплексы и устойчиво высвобождает запрограммированные мультиплексные siRNA (A, B, C-siRNA). Каждая siRNA загружается в RISC для подавления экспрессии своей целевой мРНК (A-siRNA: анти-PCSK9; B-siRNA: анти-ANGPTL3; C-siRNA: анти-APOC3).
Рисунок 2. Синтез и характеристика L-CRAM. (A, B) Схематическое изображение процесса наслоения липидов с использованием ядра в качестве ориентира. (C) Изображения, полученные с помощью просвечивающего электронного микроскопа (TEM), и (D) изображения, полученные с помощью атомно-силового микроскопа (AFM), L-CRAM. (E) Ядра РНК были мечены Cy5 во время RCT, а затем на них наносился слой липидной смеси, содержащей DOPE, меченный FAM. (F) Увеличенные изображения CLSM двойного мечения L-CRAM. (G) Распределение размеров CRAM и L-CRAM, измеренное методом NTA. (H) Количество частиц до и после нанесения липидного слоя. (I) Изменения дзета-потенциала при нанесении липидного слоя. (J, K) Профили SAXS CRAM до и после нанесения липидного слоя. (L, M) Интенсивность флуоресценции CRAM и L-CRAM, окрашенных проникающим через липидный слой РНК-красителем (SYBR Green II) и непроникающим через липидный слой красителем (RiboGreen) (n = 2); интенсивности нормированы по CRAM.
(N, O) Флуоресценция RiboGreen до и после обработки L-CRAM Triton X-100 (n = 2). Данные представлены в виде среднего значения ± стандартное отклонение.
Рисунок 3. Подтверждение опосредованной слиянием внутриклеточной локализации и уклонения L-CRAM от лизосом. (A) Изображения, полученные с помощью CLSM, клеток HepG2, инкубированных с L-CRAM в течение 3, 24 и 48 ч. Ядра окрашены Hoechst 33342; CRAM, меченные Cy5, были нанесены слоем липидов, содержащих DOPE-FAM. (B, C) Профили интенсивности зелёного и красного каналов вдоль жёлтых пунктирных линий на объединённых изображениях через 3 ч (отражающие слияние мембран) и 24 ч (отражающие интернализацию). (D) Схематическое изображение, демонстрирующее, что L-CRAM проникает в клетки по пути слияния, избегает колокализации с лизосомами и демонстрирует внутриклеточную локализацию, что обеспечивает устойчивое высвобождение siRNA. (E) Изображения CLSM клеток HepG2, инкубированных с L-CRAM в течение 24 ч и окрашенных LysoTracker Green. (F) Анализ коэффициента корреляции Пирсона (PCC), выполненный в программе ImageJ. (G, H) Ортогональные проекции, демонстрирующие внутриклеточную локализацию РНК и лизосом. РНК была мечена Cy5 (красный цвет), лизосомы — LysoTracker Green (зеленый цвет), а ядра — Hoechst 33342 (синий цвет).
Масштабные линейки: 10 мкм. (I) Анализ линейных профилей зелёной и красной флуоресценции вдоль жёлтых пунктирных линий, иллюстрирующий отсутствие колокализации с лизосомами. (J) Клеточное поглощение меченного Cy5 L-CRAM клетками HepG2 при различных обработках ингибиторами; поглощение количественно оценено с помощью цитометрии изображений (n = 3). Данные представлены в виде среднего значения ± стандартное отклонение.
Рисунок 4. Устойчивое и мультиплексное подавление экспрессии генов in vitro с использованием программируемого L-CRAM. (A) Схема многомодульных L-CRAM, обеспечивающих устойчивое и мультиплексное подавление экспрессии генов. (B) Схема Dicer-опосредованного расщепления CRAM на siRNA. (C) Анализ методом PAGE временной зависимости образования siRNA из CRAM после обработки Dicer в течение 24 и 48 ч. (D) Уровни мРНК APOC3 в клетках HepG2, обработанных одномодульным L-CRAM, нацеленным на APOC3, при различных концентрациях РНК (n = 3). (E) Уровни мРНК APOC3 в клетках HepG2 после обработки L-CRAM или LNP на основе DLin-MC3-DMA (MC3-LNP) (одинаковая доза siRNA — 50 нМ) в течение 2, 3, 4 или 7 дней (n = 3). (F–H) Схемы одно- или двухмодульных L-CRAM, кодирующих A-сиРНК (анти-PCSK9), B-сиРНК (анти-ANGPTL3) или обе. (I, J) Уровни мРНК в клетках HepG2, обработанных одномодульными (A или B) или двухмодульными (AB) модулями (n = 3). (K) Схема трехмодульного L-CRAM, кодирующего A-, B- и C-сиРНК (анти-APOC3). (L) Уровни мРНК в клетках HepG2, обработанных трехмодульным (ABC) комплексом (n = 3). Уровни мРНК количественно определяли методом RT-qPCR через 48 ч после инкубации с L-CRAM. Данные представлены в виде среднего значения ± стандартное отклонение. Статистический анализ: однофакторный дисперсионный анализ (ANOVA) с тестом Туки для множественных сравнений для (D), (I) и (J); множественные непарные двусторонние t-тесты с поправкой Холма–Сидака для множественных сравнений (α = 0,05) для (E); двусторонний t-тест Стьюдента для (L).
Статистическая значимость: ns — не значимо; P ≤ 0,05; * P ≤ 0,01; *** P ≤ 0,001; **** P ≤ 0,0001.
Рисунок 5. Биораспределение in vivo и гиполипидемический эффект L-CRAM. (A) Флуоресцентные изображения основных органов через 2 и 6 ч после введения PBS или L-CRAM, меченного Cy5. Сокращения органов: Li — печень; Lu — легкие; H — сердце; Sp — селезенка; Ki — почки. (B) Изображения ткани печени, полученные с помощью CLSM, через 6 ч после введения PBS или L-CRAM, меченного Cy5; (C) Увеличенные изображения печени мышей, которым вводили L-CRAM. (D, F) Анализ с помощью проточной цитометрии, количественно оценивающий специфическую для типов клеток печени интернализацию L-CRAM, меченного Cy5. (G, H) Количественная оценка процента Cy5-положительных клеток и средней интенсивности флуоресценции (MFI) для каждого типа клеток (n = 3). (I) Схематическое изображение механизма, посредством которого подавление экспрессии APOC3 в печени снижает уровень триглицеридов (ТГ) и липопротеинов, богатых триглицеридами (TRL). (J) Уровни мРНК APOC3 в печени мышей через три дня после введения siAPOC3 L-CRAM в дозе 2 или 4 мг/кг−1 (n = 3). (K) График лечения и забора крови для оценки гиполипидемического эффекта. (L, M) Уровни ТГ (L) и ЛПНП/ЛПОНП (M) в сыворотке крови у мышей, получавших siAPOC3 L-CRAM (n = 3). Данные представлены в виде среднего значения ± стандартное отклонение. Статистическая обработка: двусторонний дисперсионный анализ (ANOVA) с тестом Сидака для множественных сравнений для (G), (H), (L) и (M); односторонний дисперсионный анализ (ANOVA) с тестом Тьюки для множественных сравнений для (J). Статистическая значимость: ns — не значимо; P ≤ 0,05; * P ≤ 0,01; *** P ≤ 0,001; **** P ≤ 0,0001.
«Это платформа, позволяющая доставлять большое количество siRNA с помощью небольшого количества частиц и регулировать несколько генов с помощью одной частицы» - отметил профессор Ли Чжон Бом, добавив: «Ее можно использовать не только для лечения сложных метаболических заболеваний, но и для разработки РНК-препаратов длительного действия при лечении рака и воспалительных заболеваний».
Результаты данного исследования, проведенного при поддержке Министерства науки и ИКТ Южной Кореи и Корейского фонда научных исследований, опубликованы в международном научном журнале «Advanced Functional Materials».
Комментарии