В Корее обнаружили, что существующий препарат от сердечно-сосудистых заболеваний дает превосходный лечебный эффект при болезни Паркинсона
Корреспондент Гу Бон Хёк
- Выявлен механизм нейропротективного действия прасугрела (Prasugrel)
- Зафиксирован процесс защиты клеток мозга и подавления их воспаления
Исследовательская группа Корейского института исследования мозга, проводившая данное исследование [предоставлено Корейским институтом исследования мозга]
Корейские ученые, используя подход «перепрофилирования» существующих лекарств, обнаружили новое перспективное вещество для лечения болезни Паркинсона.
11 августа Корейский институт исследования мозга (KBRI) сообщил, что исследовательская группа во главе с доктором Юн Чжон Хёком доказала эффективность препарата «прасугрел» (Prasugrel), ранее применявшегося для лечения сердечно-сосудистых заболеваний, в лечении и профилактике болезни Паркинсона.
Болезнь Паркинсона — второе по распространенности дегенеративное заболевание головного мозга после болезни Альцгеймера. В результате разрушения дофаминовых нейронов, регулирующих двигательную функцию, появляются такие симптомы, как тремор рук и мышечная ригидность. Однако большинство применяемых в настоящее время лекарственных средств лишь облегчают симптомы, но не способны коренным образом остановить прогрессирование болезни.
Предложение нового препарата для лечения болезни Паркинсона на основе выяснения молекулярного механизма с помощью омик и науки о данных.
По часовой стрелке: скрининг библиотеки лекарственных препаратов; выявление функциональных сигнальных модулей на основе омик и науки о данных; верификация функциональных сигнальных модулей на клеточном уровне; и многоаспектная верификация эффективности вещества-кандидата на уровне животных
[Предоставлено Корейским институтом исследования мозга]
Исследовательская группа использовала метод «перепрофилирования лекарственных средств» (Drug repurposing), направленный на поиск новых применений для препаратов, безопасность которых уже подтверждена. Среди лекарств, одобренных Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США (FDA), в качестве потенциального лечебного средства был выбран прасугрел, после чего к нему была применена «технология на базе омик и науки о данных» (технология анализа больших данных о протеоме). В результате было установлено, что прасугрел одновременно предотвращает гибель клеток головного мозга и блокирует процессы передачи сигналов, вызывающих воспалительную реакцию.
Эти результаты получили свое подтверждение в ходе экспериментов на животных (мышах) с индуцированной болезнью Паркинсона. Прасугрел, введенный перорально, успешно проник из крови в мозг и обеспечил защиту дофаминовых нейронов. В ходе последующей оценки двигательных функций (эксперимент на ротароде) у мышей наблюдалось значимое восстановление способности к ходьбе и двигательной активности.
Рис. 1. Нейропротективный эффект прасугрела в первичных культивированных нейронах (ПКН).
а) Библиотека препаратов, одобренных FDA (10 мкМ), была оценена с помощью теста CCK-8 для определения восстановления жизнеспособности клеток. б) Гистограмма, демонстрирующая, что прасугрел защищал ПКН от воздействия 200 мкМ MPP+. в) Прасугрел не оказывал цитотоксического действия на ПКН. Результаты представлены в виде среднего значения ± SEM (n = 4–6). г) Типичные изображения, демонстрирующие гибель нейронов, вызванную MPP+, и защитный эффект предварительной обработки прасугрелем. Масштабная линейка = 50 мкм. д) Количественная оценка длины нейритов MAP2-положительных нейронов. Результаты трёх независимых экспериментов представлены в виде среднего значения ± SEM (n = 3). ***p < 0,001 по сравнению с контролем и ##p < 0,01, ###p < 0,001 по сравнению с группами, получавшими носитель (группа, обработанная MPP+). Статистический анализ проводился с использованием ANOVA с множественными сравнениями по Бонферрони. PCN — первичные корковые нейроны; MPP+ — 4-фенилпиридиний; CCK8 — набор для подсчёта клеток Cell Counting Kit-8; ANOVA — дисперсионный анализ; SEM — стандартная ошибка среднего; FDA — Управление по контролю за продуктами и лекарствами; MAP2 — белок 2, ассоциированный с микротрубочками.
Рис. 2. Сравнительный протеомический анализ PCN и BV2 при лечении прасугрелем.
а) Диаграмма Венна идентифицированных белков PCN и клеток BV2. На графиках «вулкан» показаны белки со значимой дисрегуляцией. На осях отложено значение –log10 (p-значение) в зависимости от логарифма по оси x (log2) кратности изменения. б) Сравнительный анализ канонических путей протеомов PCN и BV2 с использованием IPA. Оранжевый и синий цвета обозначают канонические пути с положительными и отрицательными Z-оценками, соответственно, для активации путей. Параметры анализа: пороговое значение Z-показателя = 0,5; –log (p-значение) > 1,3. в) Наиболее значимые взаимодействия белок-белок (PPI) в протеомах PCN, причем повышенные и пониженные уровни белков обозначены красным и зеленым цветами соответственно. г) Наиболее значимые взаимодействия белок-белок (PPI) в протеомах BV2, причем повышенные и пониженные уровни белков обозначены красным и зеленым цветами соответственно. д) Сигнальный путь апоптоза в протеоме PCN. Красный и зеленый цвета обозначают повышение и понижение экспрессии, соответственно, в протеоме, обработанном MPP+, по сравнению с протеомом, обработанным MPP++прасугрелем. f) Сигнальный путь нейровоспаления в протеомах BV2. Красный и зеленый цвета обозначают повышение и понижение экспрессии, соответственно, в протеоме, обработанном LPS, по сравнению с протеомом, обработанным LPS + прасугрелем. IPA — Ingenuity Pathway Analysis; PCN — первичные корковые нейроны; PPI — белок-белковые взаимодействия; MPP+ — 4-фенилпиридиний.
Рис. 3. Антиапоптотический эффект прасугрела в PCN.
a) Уровни АФК, измеренные с помощью DCF-DA в PCN (n = 6). b) Вестерн-блоттинг, демонстрирующий, что прасугрел снижал индуцированную MPP+ фосфорилирование JNK и p38 в PCN. c) Денситометрический анализ результатов вестерн-блоттинга (n = 4). d) Визуализация MMP с помощью красителя TMRE в PCN. Масштабная линейка = 50 мкм. e) Количественный график интенсивности флуоресценции TMRE в PCN (n = 6). f) Уровни экспрессии мРНК апоптотических факторов, измеренные методом RT-qPCR (n = 4). p < 0,05, *p < 0,01 и ***p < 0,001 по сравнению с контролем и #p < 0,05, ##p < 0,01 и ###p < 0,001 по сравнению с растворителями. Статистический анализ проводили с помощью ANOVA с многократными сравнениями по Бонферрони. DCF-DA, 2′,7′-дихлордигидрофлуоресцеин диацетат; ROS, активные формы кислорода; PCNs, первичные корковые нейроны; MPP+, 4-фенилпиридиний; JNK, c-Jun-N-терминальная киназа; TMRE, тетраметилродамин; RT-qPCR, количественная полимеразная цепная реакция в реальном времени; ANOVA, дисперсионный анализ.
Рис. 4. Прасугрел ингибирует LPS-индуцированную миграцию микроглиальных клеток BV2.
а) Типичные изображения, демонстрирующие ингибирование прасугрелем миграции микроглиальных клеток BV2. На верхних панелях представлены изображения, полученные через 4 ч после предварительной обработки прасугрелем, до закрытия раны, индуцированного ЛПС, тогда как на нижних панелях — изображения, полученные через 24 ч после обработки ЛПС. Масштабная линейка = 200 мкм. б) Количественная оценка мигрировавших клеток (среднее значение ± SEM (n = 3/группа)). в) Измеренные площади закрытия царапин. Результаты трёх независимых экспериментов представлены в виде средних значений. p < 0,05 и *p < 0,01 по сравнению с контролем и #p < 0,05 по сравнению с растворителями. Статистический анализ проводился с использованием ANOVA с многократным сравнением по Бонферрони. LPS — липополисахарид; SEM — стандартная ошибка среднего; ANOVA — дисперсионный анализ.
Рис. 5. Противовоспалительное действие прасугрела в микроглиальных клетках BV2.
a) Результаты вестерн-блоттинга, демонстрирующие, что прасугрел ингибировал фосфорилирование p38, индуцированное 1 мкг/мл LPS, в клетках BV2. b) Денситометрический анализ вестерн-блоттов (n = 3 в каждой группе). c) Типичные изображения, демонстрирующие ядерную транслокацию p65 в клетках BV2. Масштабная линейка = 30 мкм. d) Количественная оценка ядерного p65 с использованием CellProfiler v 3.0 (n = 22–27). e) Вестерн-блоттинг, демонстрирующий, что прасугрел ингибировал путь NF-κB в клетках BV2. f) Денситометрический анализ результатов вестерн-блоттинга (n = 4). g) Результаты RT-qPCR, показывающие, что прасугрел значительно снижал уровни мРНК воспалительных цитокинов и хемокинов в микроглии BV2 (n = 3–4/группа). p < 0,01 и *p < 0,001 по сравнению с контролем и #p < 0,05 и ###p < 0,001 по сравнению с растворителями. Статистический анализ проводился с использованием ANOVA с многократными сравнениями по Бонферрони. LPS — липополисахарид; NF-κB — ядерный фактор каппа B; RT-qPCR — количественная полимеразная цепная реакция в реальном времени; ANOVA — дисперсионный анализ.
Рис. 6. Прасугрел защищает от гибели дофаминергических нейронов в мышиной модели БП, индуцированной MPTP.
a) График, показывающий время пребывания на стержне (среднее ± SEM (n = 9–10/группа)). b) Вестерн-блоттинг, демонстрирующий, что прасугрел восстанавливает уровни ТГ в STR. c) Денситометрический анализ результатов вестерн-блоттинга (n = 4–5/группа). d) Типичные изображения, показывающие, что прасугрел сохраняет сниженные под действием MPTP уровни ТГ как в STR, так и в SN. Масштабная линейка = 100 мкм. е) Количественные графики интенсивности TH+ в STR и количества TH+-клеток в SN (n = 3–4/группа). p < 0,05 и **p < 0,001 по сравнению с контролем и #p < 0,05 по сравнению с группой, получавшей носитель. Статистический анализ проводили с помощью ANOVA с многократными сравнениями по Бонферрони. MPTP — 1-метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрагидропиридин; PD — болезнь Паркинсона; SEM — стандартная ошибка среднего; TH — тирозингидроксилаза; STR — стриатум; SN — черная субстанция; ANOVA — дисперсионный анализ.
Рис. 7. Прасугрел снижал активацию микроглии в мышиной модели БП, индуцированной MPTP.
а) Типичные изображения, демонстрирующие, что прасугрел ингибировал активацию микроглии, но не влиял на активацию астроцитов. Масштабная линейка = 50 мкм. б) Количественные графики интенсивности флуоресценции Iba-1 (n = 3–4/группа). в) Количественные графики интенсивности флуоресценции GFAP (n = 3–4/группа). **p < 0,01 по сравнению с контрольной группой и #p < 0,05 по сравнению с группой, получавшей носитель. Статистический анализ проводили с помощью ANOVA с многократными сравнениями по Бонферрони. MPTP — 1-метил-4-фенил-1,2,3,6-тетрагидропиридин; PD — болезнь Паркинсона; GFAP — глиальный фибриллярный кислый белок; Iba-1 — молекула-адаптер, связывающая ионизированный кальций 1; ANOVA — дисперсионный анализ.
Таблица 1. Концентрация транс-R-138727 в головном мозге после перорального введения прасугрела (10 мг/кг).
Концентрация транс-R-138727, измеренная методом ЖХ-МС/МС после перорального введения прасугрела (10 мг/кг) в ткани головного мозга мышей. Данные представлены в виде среднего значения ± SEM (n = 3). ***p < 0,001 по сравнению с контрольной группой. Статистический анализ проводился с использованием двустороннего t-критерия.
«Целью данного исследования было преодолеть ограничения существующих методов перепрофилирования лекарственных средств и предложить новую методологию поиска веществ для лечения болезни Паркинсона, определив точный механизм действия с помощью инновационного подхода, основанного на омик и науке о данных» - сказал доктор Юн Чжон Хёк, добавив: «В будущем мы намерены использовать новоразработанную технологию для содействия разработке новых стратегий диагностики и лечения заболеваний головного мозга».
В настоящее время исследовательская группа завершила подачу патентных заявок в Южной Корее и за рубежом и изучает возможности передачи технологии.
Результаты данного исследования, проведенного при поддержке Корейского фонда научных исследований, опубликованы в последнем номере международного научного журнала по нейробиологии «npj Parkinson's Disease».
Комментарии